1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、TEMED均为Sigma产品，TritonX-100、苯甲基磺酰氟为Serva产品，DEAE-SephadeX、XG-75为phamacia产品，RPMI1640为GIBCO产品，CD3、CO4、CD8、CD11b、HLA-DR单抗为北京军事医学科学院产品。K562和SHG-44细胞系由苏州医学院脑研室提供，HOS-8603细胞系由第二军医大学病理教研室提供。本组11例骨肉瘤患者均为苏州医学院附一院骨科住院病人，均经手术治疗和病理诊断证实。其中男7例，女4例，年龄14～51岁，平均23岁。
1.2 骨肉瘤相关抗原的提取及鉴定［2］
抗原提取：将HOS-8603细胞系大量扩增至1×107/ml时收获，以pH7.2，0.2mol/L PBS洗2遍，离心后沉淀中加入含2%TritonX-100细胞裂解液20ml剧烈振荡混匀1min，置4℃PBA液中透析48h，过滤除菌后加入50%饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白质，离心后取沉淀溶解同上PBS中，0.4μm滤膜过滤后作自动层析分离纯化获得细胞膜粗提液，Folin酚试剂测得蛋白质含量为10mg/ml，对pH6.5 ，0.1mol PBS在4℃透析过液，以相同PBS平衡DEAE-SephadeX层析柱后上样层析，以pH 6.5，0.1mol/min，收集不同峰值下的洗脱液装透析袋对0.15mol Nacl,pH7.2， 0.02mol PBS透析并吹干浓缩，以SDS-PAGE测定分子量。Western-blot分析：样品以SDS-PAGE平板电泳4～5h，电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，然后将NC膜置20%FCS-PBS缓冲液中4℃封闭过液，充分洗涤后置于骨肉瘤单抗稀释液中，37℃孵育2h，充分洗涤后加入联苯二胺(DAB)显色，15min后中止反应。
1.3 OSS-CTL诱导
OSS-CTL诱导：用Ficoll-HyPaque新鲜分离骨肉瘤患者外周血淋巴细胞(PBMC)，用人血清培养液调整细胞浓度为5×105／ml后置于CD3单抗包被（10μg/ml）的培养瓶中，加入OSAA66(10μg/ml)刺激培养，3d后移至一般培养瓶中加入IL-2 100u/ml，OSAA保持原来浓度继续诱导培养。
1.4 细胞毒活性检测［3］
采用吴厚生〔3〕H-TdR释放法，效靶比为50∶1。细胞毒活性(%)=(实验组CPM-自然释放组CPM)/(最大释放组CPM-自然释放组CPM)×100%。
1.5 流式细胞仪检测细胞表型
取待测细胞206/ml加入U型孔内，再加入CD3、CD4、CD8、CD11b、HLA-DR单抗各20μl/孔，4℃孵育30min，充分洗涤后加入FITC-羊抗鼠4℃30min，洗涤后上样分析。
1.6 抗肿瘤活性检测
将人骨肉瘤HOS-8603细胞(5×106)，接种NC裸鼠肩背部皮下，接种成功2周后随机分成3组，每组6只，通过尾静脉注射治疗，5d 1次，连续治疗5次。用游标卡尺测量肿瘤的短径(W)和最大长径(L)观察肿瘤生长情况。计算公式：肿瘤体积=L×W2/Z。治疗方法：生理盐水对照组：0.2ml/只；单纯OSS-CTL组：2×107/0.2ml/只；OSS-CTL/IL-2组：2×107/0.2ml/只，IL-2 104u只。
2 结果
2.1 OSAA的纯化与鉴定
HOS-8603细胞膜粗提液经DEAE-Sephadex层析，获得5种不同峰值的洗脱液，再经SephadexG-50浓缩脱盐获得5种膜蛋白组分，分别与骨肉瘤单抗进行Western blot分析，结果其中第3种膜蛋白组分显示阳性反应，而其他组分呈阴性反应，提示第3种膜蛋白组分是骨肉瘤单抗识别的OSAA，经SDS-PAGE分析为单一条带，分子量为66K.2、OSAA66浓度对致敏淋巴细胞增殖的影响：骨肉瘤致敏淋巴细胞在不同浓度的OSAA66条件下培养4d后检测细胞增殖指数。结果表明，当OSAA66浓度由0增加到10μg/ml时，其3H-TdR掺入量显著增加(P＜0.05)；当10μg/ml增加到20μg/ml时，3H-TdR掺入量增加不显著(P＞0.05);当超过20μg/ml时，3H-TdR掺入量反而减少。提示，骨肉瘤致敏淋巴细胞的增殖需要合适的OSAA66浓度，最佳刺激剂量为10μg/ml。
2.2 OSS-CTL表型特征
流式细胞仪检测诱导培养14d的OSS-CTL表型，其中CD3+87.6±6.3%,CD4+24.7±4.1%,CD8+94.7±5.3%,CD11b+1.9±0.7%,HLA-DR＋79.3±8.7%。提示OSS-CTL是以CD3+CD8+CTL为主的异质细胞群。
2.3 OSS-CTL细胞毒活性检测
诱导培养21d的OSS-CTL对HOS-8603骨肉瘤细胞的杀伤活性为97.3%，对自体骨肉瘤细胞为92.6%，而对K562和SHG-44细胞的杀伤活性分别为11.5%和19.3%，显著低于前2组(P＜0.01)。提示OSS-CTL对OSAA有关的肿瘤细胞显示高效特异杀伤活性。
2.4 OSS-CTL对荷瘤裸鼠的治疗作用
生理盐水对照组，肿瘤结节生长较快，至治疗结束时肿瘤体积达0.74cm3；单纯OSS-CTL组，肿瘤生长迟缓，治疗结束时肿瘤体积与生理盐水组相比有显著差异(P＜0.05)；OSS-CTL/IL-2组，肿瘤生长明显受抑制，治疗结束时肿瘤体积显著小于生理盐水组(P＜0.01)和单纯OSS-CTL组(P＜0.05)。观察裸鼠的生存期表明，3组裸鼠在治疗期间没有死亡，但生理盐水对照组裸鼠在治疗结束时已开始进入恶液质状态，治疗结束后第2、3周陆续死亡；单纯OSS-CTL组，治疗结束后第2周进入恶液质状态，第、4、5周内陆续死亡；而OSS-CTL/IL-2组，第4周才进入恶液质状态，第6、7、8周分别死亡。由此表明，OSS-CTL对荷人骨肉瘤裸鼠具有显著的治疗作用，而IL-2又可明显提高其治疗效果。
3 讨论
体外诱导TS-CTL作为新的免疫效应细胞的特异性过继免疫治疗已成为近年来肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。TS-CTL过去常用淋巴-肿瘤细胞混合培(Mixed Lymphocyte-Tumor Cell Culture,MLTC)方法诱导，但该方法需要获得肿瘤组织及建立稳定的细胞系，从而耗费大量的时间；又因诱导出的TS-CTL中带有一定量的肿瘤细胞，回输病人有可能形成新的转移灶的危险，故不宜在临床上推广应用。近年来，随着抗原递呈和T细胞活化机制的进一步阐明，肿瘤抗原替代肿瘤细胞激活CTL成为可能，从而避免MLTC的上述缺点。首先是外源性肿瘤抗原被抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC)吞噬加工后也可由MHC-I类分子提呈给CD8+CTL［4、5］。
其次是CTL前体的活化依赖于双信号学说，即抗原刺激和共刺激因子的辅助作用。另外，大量的研究结果表明，肿瘤患者外周血淋巴细胞中含有丰富的CTL前体［6］。由于外周血中存在一些免疫抑制因子(如TGF-β)及缺乏共刺激因子，抑制了CTL的杀伤活性，但经IL-2等细胞因子激活后便成为极好的抗肿瘤效应细胞。根据以上理论基础，本研究通过生化方法提取的OSAA66与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞诱导出以CD3+CD8+CTL为主的异质细胞群。实验结果表明，该细胞群对OSAA相关的HOS-8603细胞和新鲜骨肉瘤细胞显示高亲和杀伤活性，而对OSAA无关的K562和SHG-44细胞显示微弱的非特异杀伤活性。至今对肿瘤相关抗原能否诱导特异性的细胞毒性细胞的问题，仍有争议。本实验结果为上述观点的成立提供了佐证。其机制可能有以下几点：(1)肿瘤患者外周血淋巴细胞当中富含APC，因而可将可溶性抗原提供给CD8++CTL；(2)低剂量IL-2与CD3单抗的协同效应，获得特异性较好的CD8+CTL；(3)CD3单抗、肿瘤相关抗原的刺激，使致敏T细胞IL-2R的表达量增加，对IL-2的反应增强［7］；(4)CD3单抗可使TCR-CD3复合物交联［8］；(5)肿瘤患者外周血淋巴细胞已被肿瘤相关抗原致敏并对其产生记忆，当第2次接触相同抗原时细胞迅速增殖，并显示特异的杀伤活性［9］。
体内实验表明，单纯OSS-CTLS可明显抑制荷瘤生长和延长裸鼠生存时间，而同时注射IL-2可显著提高OSS-CTL的抗瘤效应。总之，本实验方法成功地诱导了高效的OSS-CTL，弥补了MLTC的不足，可望成为骨肉瘤免疫治疗的新途径
